裸鼠成瘤实验技巧及常见问题

2、裸鼠成瘤实验技巧

（1）细胞的状态是成瘤实验的关键，所以细胞生长状态一定要好，取处于对数生长期的细胞，细胞达80-90%左右密度为宜。收集细胞前一天晚上更换新鲜培养基。

（2）胰酶消化细胞后用预冷的PBS洗两遍，目的为去除细胞中残余的血清。

（3）用PBS或者无血清培养基吹打细胞沉淀至合适的浓度，一般皮下瘤接种的细胞量为1-5×10^6个细胞/支，接种体积为0.1-0.2ml，因此细胞悬液的浓度为1-5×10^7个细胞/ml，如若有条件的实验室，也可以加基质胶以加速瘤块的生成，基质胶与PBS或无血清的比列为1:1。

（4）细胞消化后应尽快接种到裸鼠皮下，一般尽量在半小时内完成（如果接种量大，可以分批接种），途中将细胞悬液放在冰上降低细胞的代谢以保持细胞的活性。

（5）选择的裸鼠一般在4-6周龄，体重16-18g左右，种植部位选择血供丰富区域，如腋窝中后部。

（6）接种前用枪将细胞悬液充分的吹散，防止细胞成团而降低细胞成活率，并且导致小鼠接种细胞数量的差异过大。

（7）接种时，针头在皮下进针深一点，约1cm深，针头在皮下左右滑动几次，以便细胞接种成团，减少注射后细胞悬液从针眼溢出。

（8）如何保定裸鼠?左手拇指和食指捏紧裸鼠颈背部皮肤，小拇指夹住裸鼠尾巴。

（9）接种后1-2周左右可以见到皮下开始出现肿块。

（10）根据肿瘤细胞的特性和接种细胞的量，一般皮下成瘤的周期为1-2个月。肿瘤不宜生长过大，一般不要超过2000mm3。

（11）肿瘤大小测量一般为1周两次，游标卡尺测量肿瘤最长和最短部位。V=1/2*a*b2 (a为长轴，b为短轴)。

（12）皮下瘤取下后一部分冻液氮用作以后提蛋白和RNA，一部分福尔马林固定用做免疫组化、免疫荧光等。

常见问题及解答

1、这个实验为什么用裸鼠而不用普通的老鼠或者小白鼠？

裸鼠成瘤实验用的裸鼠，最大的特点是没有胸腺等免疫器官，它的免疫力几乎为零，对肿瘤细胞没有免疫作用，易于成瘤。

2、瘤块长起来又消失？

肿瘤块先缩小，后变大很常见，很可能是炎症反应，肿瘤细胞被小鼠自身吸收，继续观察肿瘤细胞吸收之后是否经过几周还能长出来，长不起来建议换鼠。

3、是否可以在一只小鼠进行多个点接种？

不可以，一只老鼠就只能接种一个点，因为一个老鼠身上有多个肿瘤块的情况下，可能会相互影响。

4、肿瘤长不出来是怎么回事？

第一：肿瘤生长周期很慢，一周开始生长肿块，大约需要1~2个月才能长成肿瘤；

第二：可能是细胞状态差，活力不好，或是肿瘤细胞不易成瘤，需加入基质胶辅助或增大接种量或更换细胞系；

第三：一方面可能是小鼠周龄太大，或小鼠免疫排斥，建议更换免疫缺陷程度更大的小鼠（Nod-scid小鼠）。

5、肿瘤体积相差很大，大小不一？

首先，并不是所有的肿瘤都能够长得均一形态。其次，这可能跟小鼠周龄及接种细胞量不一致导致，建议重新接种。